路易吉·里卡迪 1 , 罗莎·马泽奥 2,*©, 安吉洛·拉ff埃莱·马科特里吉亚诺 1 , 古列尔莫·雷纳尔迪 3 保罗·约维诺 4 , 维托·佐诺 1 , 斯特凡诺·帕万 1© 和康塞塔·洛蒂 2,*
- 1 巴里大学植物遗传育种单位土壤、植物和食品科学系,Via Amendola 165/A, 70125 巴里,意大利; luigi.ricciardi@uniba.it (LR);Angelo.marcotrigiano@uniba.it (手臂); vito.zonno@uniba.it (VZ); stefano.pavan@uniba.it (SP)
- 2 福贾大学农业、食品和环境科学系,Via Napoli 25, 71122 Foggia, Italy
- 3 巴里大学生物科学、生物技术和生物制药系,Via Orabona 4, 70125 Bari, Italy; guglielmo.rainaldi@uniba.it
- 4 能源技术部,生物能源、生物精炼和绿色化学部,ENEA Trisaia 研究中心,SS 106 Ionica, km 419+500, 75026 Rotondella (MT),意大利; paolo.iovieno@enea.it
* 对应: rosa.mazzeo@unifg.it (R M); concetta.lotti@unifg.it (CL)
摘要:
洋葱 (洋葱 L.) 是世界上第二重要的蔬菜作物,因其健康益处而受到广泛赞赏。尽管洋葱具有重要的经济重要性和作为功能性食品的价值,但其遗传多样性的研究却很少。在此,我们调查了“Acquaviva红洋葱”(ARO)的遗传变异,这是一种在巴里省(意大利南部普利亚大区)小镇上拥有百年种植历史的地方品种。使用一组 11 个微卫星标记来探索由 13 个 ARO 群体和 XNUMX 种常见商业类型组成的种质库中的遗传变异。使用参数和非参数方法对遗传结构进行的分析强调,ARO 代表了一个明确的基因库,与经常被误认为的特罗佩亚和蒙托罗地方品种明显不同。为了提供通常用于新鲜消费的球茎的描述,对可溶性固形物含量和刺激性进行了评估,显示 ARO 相对于上述两种地方品种具有更高的甜度。总体而言,本研究对于 ARO 的未来增值很有用,可以通过质量标签来促进 ARO 的增值,从而有助于限制商业欺诈并提高小农的收入。
介绍
葱属包括约 750 种 [1],其中洋葱 (Allium cepa L., 2n = 2x =16) 是分布最广泛的物种之一。 A. cepa 具有两年一次的循环和异交繁殖行为。如今,洋葱的全球产量(97.9 公吨)使其成为仅次于番茄的第二重要蔬菜作物 [2]。自古以来,洋葱球茎就被用作食品和民间药用。事实上,古埃及人已经在公元前 1550 年的医学纸莎草纸《埃伯斯法典》中报道了几种基于大蒜和洋葱使用的治疗配方 [3]。
这种多功能且健康的蔬菜可以生吃、新鲜食用或作为加工产品食用,并用于增强许多菜肴的味道。最近的几项研究声称,食用洋葱可以降低心血管疾病[4,5]、肥胖[6]、糖尿病[7]和各种癌症[8-10]的风险。洋葱的健康特性通常归因于高含量的两类营养化合物:类黄酮和烷(烯)基半胱氨酸亚砜(ACSO)。第一类包括黄酮醇和花青素。槲皮素是主要可检测的黄酮醇,以其在自由基清除和过渡金属离子结合方面的强抗氧化和抗炎特性而闻名 [11];而花青素赋予某些洋葱品种红色/紫色。对于 ACSO,最丰富的是异蒜氨酸 [(+)-反式-S-1-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜] [12],一种储存在细胞中的非挥发性、非蛋白性硫氨基酸,间接导致洋葱的辛辣香气和味道 [13]。组织破坏后,异蒜氨酸被蒜氨酸酶裂解,产生一系列挥发性化合物(丙酮酸盐、氨、硫代磺酸盐和丙硫醛 S-氧化物),这些化合物会引起撕裂并产生难闻的气味(刺鼻) [14]。洋葱辛辣度通常以每克鲜重水解产生的丙酮酸的量来衡量 [15,16].
在地中海盆地国家,提议作为第二多样性中心之一 A. cepa [17,18],洋葱球茎在形状、大小、颜色、干物质和刺激性方面表现出很大的变化 [19-一]。此外,硫肥、农艺实践、土壤类型、气候条件以及品种或地方品种的基因型可以通过赋予特殊的感官和营养价值来影响球茎的质量 [23-一]。在意大利,尽管洋葱种质资源广泛,但只有少数洋葱品种经常接受科学研究并正确表征 [28,29].
农业生物多样性的彻底遗传和表型特征对于确保植物遗传资源的适当保护和促进特定基因型在价值链中的使用至关重要 [30-一]。通常选择简单序列重复 (SSR) 标记进行作图 [33-一]、DNA指纹分析和品种鉴别 [36-一],以及地方品种内部和之间遗传变异的可靠估计 [39-一],因为它们是位点特异性的、多等位基因的、共显性遗传的、高度可重复的并且适合自动基因分型。
在本研究中,我们将注意力集中在阿普利亚传统地方品种“Acquaviva 红洋葱”(ARO)上,该品种是在巴里省 Acquaviva delle Fonti 镇的一小片地区按照有机耕作方法种植的。 (普利亚,意大利南部)。这种地方品种的球茎大而扁平,呈红色,主要用于当地食谱中。尽管 ARO 获得了“慢食主席团”质量标志,但其生产可以通过欧盟质量标志(例如受保护的地理标志(PGI)和受保护的原产地名称(POD))进一步促进和保护,因为这些可能有助于限制商业欺诈并提高小农的收入。在此,SSR 分子标记被用作评估 ARO 群体之间遗传变异的强大工具,并将该地方品种与其他两种意大利南部红洋葱地方品种区分开来。此外,我们还估计了辛辣味和可溶性固形物含量,以评估 ARO 风味与市场需求的关系。
成果
Acquaviva红洋葱种质资源库的建立及形态学表征
农民在 BiodiverSO 普利亚地区项目框架内捐赠的 13 个 ARO 地方品种种群的种子被用来建立 ARO 种质库。
在 ARO 种质和三种洋葱地方品种中收集了与球茎、皮肤和果肉相关的形态描述符,其中两种属于“特罗佩亚红洋葱”(TRO) 地方品种,一种属于“蒙托罗铜洋葱”(MCO) 地方品种(图 1)。所有 ARO 球茎都是扁平的,其特征是红色的外皮和果肉具有不同的红色深浅。相比之下,TRO 球茎的果肉是全红色的,而 MCO 球茎的果肉颜色很差(表 S1)。生化分析可以评估固体可溶物含量和刺激性。如表所示 1, ARO群体中球茎的固溶物含量平均值为7.60,范围为6.00(ARO12)至9.50°白利糖度(ARO11和ARO13)。该值高于 TRO 和 MCO 地方品种的估计值(分别为 4.25 和 6.00° Brix)。
表1。 在“Acquaviva 红洋葱”(ARO)、“Tropea 红洋葱”(TRO) 和“Montoro 铜洋葱”(MCO) 群体中评估的固体可溶物含量和刺激性值*。
守则 | 可溶性固体含量(糖度) | 辛辣味(p莫尔格–1 固件) | ||
平均值 | CV y (%) | 平均值 | CV y (%) | |
ARO1 | 6.25D * | 5.65 | 5.84 ab * | 23.78 |
ARO2 | 7.25直流 | 4.87 | 在6.51 | 22.98 |
ARO3 | 7.50 BCD | 9.42 | 5.28腹 | 22.88 |
ARO4 | 7.50 BCD | 0.00 | 在6.97 | 3.74 |
ARO 5 | 7.50 BCD | 0.00 | 在6.80 | 9.68 |
ARO6 | ð6.25 | 5.65 | 4.51腹 | 39.18 |
ARO7 | 7.25直流 | 4.87 | 5.25腹 | 15.44 |
ARO8 | AB 9.00 | 0.00 | 在7.04 | 3.49 |
ARO9 | 8.25 ABC | 4.28 | 在6.84 | 0.15 |
ARO10 | 7.00直流 | 0.00 | 5.94腹 | 6.57 |
ARO11 | 9.50A | 7.44 | 5.54腹 | 16.43 |
ARO12 | ð6.00 | 0.00 | 4.91腹 | 9.70 |
ARO13 | 9.50A | 7.44 | 在6.63 | 24.93 |
MCO | ð6.00 | 0.00 | 4.18腹 | 2.66 |
特罗1 | Ë4.25 | 8.31 | 2.80 b | 2.10 |
特罗2 | Ë4.25 | 8.31 | 4.28腹 | 4.79 |
* 具有相同大写或小写字母的平均值分别在 0.01P 或 0.05P 时没有统计学差异(SNK 测试)。 y 变异系数。
通过丙酮酸含量评估的 ARO 刺激性平均值为 6.00,范围为 4.51 pmol g-1 固件 (ARO6) 至 7.04 (ARO8)。该值高于 TRO 和 MCO 地方品种的估计值(3.54 pmol g-1 FW 和 4.18 pmol g-1 分别为FW)。
SSR多态性和种质间的遗传关系
在本研究中,11个测试的SSR引物组合中有37个提供单基因座多态性,即在单个个体中最多产生两个扩增产物。总体而言,在 55 名个体中检测到 320 个等位基因,每个位点的等位基因数量范围从 2 个(ACM147 和 ACM 504)到 11 个(ACM132),平均值为 5 个等位基因(表 2)。在个体群体中,等位基因数量 (Na) 的范围为 1.94 (ACM147 和 ACM504) 至 5.38 (ACM132),而等位基因的有效数量 (Ne) 的范围为 1.41 (ACM152) 至 2.82 (ACM449)。差异 Na 和 Ne 值之间的差异是由于群体中存在频率较低的等位基因,并且仅少数等位基因占主导地位。观察到的最高杂合度 (Ho) 值突出显示为 ACM138 和 ACM449 (0.62),而最低杂合度 (Ho) 值与 ACM152 (0.25) 相关。预期杂合度 (He) 对应于恐慌群体的理论预期,范围为 0.37 (ACM504) 到 0.61 (ACM132、ACM138 和 ACM449)。赖特固定指数 (Fis) 显示所有标记的值接近于零(平均 0.05),表明观察到的杂合性水平与预期杂合性水平之间的值相似,正如对异交物种的预期一样。单个SSR标记在遗传指纹中的效率通过多态信息内容(PIC)指数来估计,平均值为0.48,范围为0.33(ACM504)至0.67(ACM132)。另一个效率指数,香农信息指数 (I),其平均值为 0.84,假设值范围为 0.45 (ACM152) 到 1.20 (ACM132)。
表2。 用于估计 ARO、TRO 和 MCO 群体遗传多样性的 11 个 SSR 标记的多态性特征。等位基因总数 (Na)、条带大小范围和多态信息内容 (PIC) 指数指的是本研究中基因分型的 320 个人的总集。等位基因数 (Na)、有效等位基因数 (Ne)、观测杂合度 (Ho)、预期杂合度 (He)、固定指数 (F)is),香农信息指数(I)是指从 16 个群体计算得出的平均值,每个群体由 20 个个体组成。
轨迹。 | 总钠 | 尺寸范围(bp) | PIC单片机 | 平均值 | |||||
Na | Ne | Ho | He | I | Fis | ||||
ACM91 | 4 | 189-205 | 0.40 | 2.63 | 1.72 | 0.38 | 0.39 | 0.66 | 0.04 |
ACM101 | 4 | 229-241 | 0.52 | 2.94 | 2.37 | 0.53 | 0.56 | 0.92 | 0.06 |
ACM132 | 11 | 186-248 | 0.67 | 5.38 | 2.78 | 0.55 | 0.61 | 1.20 | 0.09 |
ACM138 | 5 | 242-272 | 0.66 | 3.69 | 2.82 | 0.62 | 0.61 | 1.09 | -0.02 |
ACM147 | 2 | 264-266 | 0.37 | 1.94 | 1.83 | 0.44 | 0.44 | 0.62 | -0.01 |
ACM152 | 4 | 228-244 | 0.25 | 2.38 | 1.41 | 0.25 | 0.27 | 0.45 | 0.07 |
ACM235 | 4 | 286-298 | 0.41 | 2.81 | 1.77 | 0.44 | 0.41 | 0.72 | -0.06 |
ACM446 | 6 | 108-120 | 0.56 | 3.50 | 2.48 | 0.49 | 0.58 | 1.01 | 0.16 |
ACM449 | 8 | 120-140 | 0.66 | 4.88 | 2.82 | 0.62 | 0.61 | 1.18 | -0.03 |
ACM463 | 5 | 202-210 | 0.47 | 3.38 | 1.95 | 0.46 | 0.48 | 0.83 | 0.05 |
ACM504 | 2 | 188-192 | 0.33 | 1.94 | 1.64 | 0.30 | 0.37 | 0.54 | 0.20 |
平均值 | 5 | 0.48 | 3.22 | 2.15 | 0.46 | 0.48 | 0.84 | 0.05 |
在种群中,ARO3、ARO6、ARO8、ARO10、TRO1 和 MCO 显示出高水平的遗传变异(Ho > 0.5),而在种群 ARO7 中观察到最低的多样性(Ho = 0.27)(补充表 S2)。总体而言,所有材料均显示 Fis 值接近于零(Fis 平均值 = 0.054),如随机交配条件下的预期。
分子变异和遗传结构分析
通过 AMOVA 计算群体间和群体内遗传变异的层次划分。结果突显了群体内很大一部分遗传变异(87%)。人群之间的差异非常显着(13%)P < 0.001)(表 3)。 Fpt 参数的成对值(类似于赖特 Fst 固定指数),范围从 0.002 (ARO2/ARO10) 到 0.468 (ARO7/TRO2),具有显着性(P < 0.05),九个成对比较除外(补充表 S3)。
表3。 320 个种群的 16 个基因型的分子变异分析 洋葱 L.
来源 | df | 平方和 | 方差估计 | 方差 (%) | Fpt | P |
在人群中 | 15 | 458.63 | 1.16 | 13% | ||
在人群中 | 304 | 2272.99 | 7.50 | 87% | 0.134 | 0.001 |
合计 | 319 | 2731.62 | 8.66 |
基因结构的研究 A. cepa 本研究中的收集基因分型是通过软件 STRUCTURE 中实施的基于混合模型的聚类分析来进行的。 Evanno AK 方法建议细分为两个簇 (K = 2),作为我们的信息最丰富的方法 数据集,与the 下页 最高体育AK 在 K = 5 (补充图 S1)。 一个 叉 = 2, a生命值op法规w埃雷屁股igned 也nØf 两个簇 rnernbertoip 系数 (q) > 0.7。作为ho进入 数字 2a,第一个簇(名为 S1)包括 MCO 和所有 ARO 种群,而 S2 簇将两个 TRO 种群分组。在 K = 5 时,提供对数据集更深入的描述(图 2b),75% 的种质被分配到五个簇之一。尽管一些 ARO 群体混合 (q < 1) 或单独分组在两个新簇 S2 和 S0.7(分别为 ARO3 和 ARO4)中,但 ARO (S7) 和 TRO (S12) 之间的分离得到了证实。有趣的是,MCO 商业类型形成了与阿普利亚红洋葱分开的独特簇(S5)。
人群之间的遗传关系
SSR多态性可以绘制遗传多样性树状图,系统发育分析结果如图所示 3a。在这里,种质收集被分为五组,得到引导值的强烈支持。 ARO7 和 ARO12 种群立即与其余种群分离并形成两个不同的簇。第三个集群包括TRO的两个商业群体,同时第四个节点将MCO从XNUMX个ARO群体中划分出来。通过主坐标分析(PCoA)进一步研究了种群之间发生的遗传关系(图 3b)。如前所述,ARO 群体紧密分组,但 ARO12 和 ARO7 除外,它们出现在 PCoA 图中的孤立位置。两个 TRO 和 MCO 群体分散在图的右下图中。
图3。 16 种基因的遗传多样性 A. cepa 本研究中根据其 SSR 概况对人群进行了表征。 (a) 遗传距离的 UPGMA 树状图。 Bootstrap 支持值 >50 会在相应节点上方标明; (b) 主成分分析 (PCoA)。红色圈出的簇与系统发育分析生成的组完全匹配,由 11 个 ARO 种质组成。
讨论
在意大利南部传统种植的大量农业生物多样性中,洋葱地方品种代表了需要保护的利基产品,以免受遗传侵蚀的风险和现代品种替代的威胁。在 BiodiverSO 区域项目的框架内,我们建立了 13 个 ARO 地方品种的种子库,旨在收集、描述、推广和保护普利亚地区与当地遗产密切相关的遗传资源。我们报告了根据 DNA 多态性和两个生化参数(可溶性固形物和丙酮酸含量)对 ARO 变异的首次评估,这些参数与风味特征相关,对于新鲜生产品的接受度具有重要意义。此外,还将 ARO 地方品种的数据与其他两种常被误认为是的色素洋葱地方品种收集的数据进行了比较。
根据甜洋葱行业指南,生化分析强调了 13 个 ARO 群体的甜度,与高可溶性固形物含量和中等刺激性相关 [31]。 ARO 球茎比 TRO 和 MCO 地方品种的球茎更甜,并且表现出稍高的刺激性。然而,洋葱的甜味是由于糖含量和辛辣味之间的平衡造成的,因此这种表征可用于支持有价值的基因型的选择,通常由农民仅根据形态进行选择。
SSR 标记被证实是区分基因型的有用工具,尽管是在 Acquaviva delle Fonti 镇等狭窄的种植区域内收集的。所选标记显示的等位基因数量比先前报道的标记要多 [43] 和 [44],但低于报告的标记 [45]。此外,我们的标记组中有 50% 显示 PIC 指数值大于 0.5,证明适合区分集合中的群体,如 [46]。对种群内多样性的评估显示 Ho 和 He 之间具有相似的值,导致 Fi 较低s 价值观。这与异型杂交的性质是一致的 A.cepa, 严重患有近亲繁殖抑郁症 [47]。整体Fis 本研究中考虑的洋葱种群计算值 (0.054) 低于之前报告的值 [45] (0.22) 几乎与由 [31] (0.08)和 [48] (0.00) 他们分别评估了来自西班牙西北部和尼日尔的洋葱地方品种的遗传多样性。 ARO 种群中值得注意的杂合性水平强化了普利亚代表许多园艺物种多样性中心的观念 [32,42,49-一].
AMOVA 强调,本研究中基因分型的集合中的大多数分子变异都存在于人群中。然而,种群之间存在显着的遗传分化(FPT 值)揭示了遗传分层的发生。事实上,尽管我们的结果表明大多数 ARO 群体存在遗传一致性,形成明确的簇,但 ARO7 和 ARO12 群体表现出明显不同的遗传特征。这一结果可能是由于收集种群的两个农民使用的种子来源不同所致。此外,根据所获得的结果,可以认为 ARO 地方品种在遗传水平上与 TRO 和 MCO 地方品种明显不同。在最近的一项研究中, [29] 评估了几种意大利洋葱地方品种的遗传多样性,包括“Acquaviva”、“Tropea”和“Montoro”。尽管作者使用 SNP 标记来评估更广泛洋葱收藏的遗传多样性,但基因分型无法区分“Acquaviva”与“Tropea”和“Montoro”洋葱。可能,这种差异是由于发现的平均 PIC 值较低 (0.292),这表明所分析的基因座的一般信息量不大,如 [29]。此外,为了调查意大利集群中子结构的存在,最好将意大利基因型与集合的其余部分分开分析。也许它可以使与地理分层或经验选择下的性状相关的遗传多样性模式可视化。
总之,本研究是关于与当地文化遗产相关且对农民具有经济重要性的洋葱地方品种的综合报告。我们的结果强调,除了少数例外,ARO 的特点是有一个明确的基因库,值得保护,免受遗传侵蚀的风险。因此,建立这一宝贵的遗传多样性来源的代表性收藏至关重要。最后,ARO 的遗传和表型特征可能有助于获得欧盟的质量标志。
材料和方法
种质采集、植物材料和 DNA 提取
一组 13 个 ARO 地方品种种群是在普利亚地区项目框架内获得的(BiodiverSO: https://www.biodiversitapuglia.it/),通过在意大利巴里省阿普利亚小镇“Acquaviva delle Fonti”执行的一系列任务。通过地理信息系统(GIS)绘制每个种质的收集地点并在表中报告 4. 此外,本研究还包括两个来自 TRO 地方品种的群体和一个来自 MCO 地方品种的群体,并用作参考。所有植物材料均在巴里大学实验农场“P Martucci”(41° 1'22.08” N,16°54'25.95” E)在相同的环境条件下生长,在保护笼下以避免异花授粉种群并通过苍蝇确保种群内授粉 (露西莉亚凯撒)。 对 16 个种群的特征进行了与鳞茎大小、形状以及皮肤和肉色相关的性状的表征(表 S1)。此外,使用手持式折光仪进行固溶物含量测定,并测量添加 2,4-二硝基苯肼(0.125%)的洋葱汁样品的刺激性。 v/v 在 2N HCl 中)并评估 420 nm 处的吸光度,如 [31]。进行邓肯多范围检验和SNK检验以确定是否存在显着差异。
表4。 本研究中收集和基因分型的人群列表。对于每个种群,都会报告识别码、本地名称、GPS 坐标和保存种子的基因库。
代码 | 名字 | GPS坐标 | 基因库 y |
ARO1 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°54’21.708″ N 16°49’1.631” E | 双SSPA |
ARO2 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°53’14.28″ N 16°48’56.879” E | 双SSPA |
ARO3 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°54’11.304″ N 16°49’13.079” E | 双SSPA |
ARO4 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°54’3.348″ N 16°40’27.011” E | 双SSPA |
ARO5 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°51’59.76″ N 16°53’0.527” E | 双SSPA |
ARO6 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°52’48.72″ N 16°49’43.247” E | 双SSPA |
ARO7 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°53’13.47″ N 16°50’23.783” E | 双SSPA |
ARO8 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°53’18.816″ N 16°49’33.888” E | 双SSPA |
ARO9 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°54“51.372英寸N 16°49“3.504= E | 双SSPA |
ARO10 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°54’1.188″ N 16°49’24.311” E | 双SSPA |
ARO11 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°52“49.8英寸N 16°49“48.575= E | 双SSPA |
ARO12 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°52’38.892″ N 16°49’28.379” E | 双SSPA |
ARO13 | 阿夸维瓦红花菜 | 40°53’21.768″ N 16°49’29.711” E | 双SSPA |
特罗1 | 特罗佩亚红花鹬 | – | 双SSPA |
特罗2 | 特罗佩亚红西波拉 | – | 双SSPA |
MCO | 蒙托罗西波拉玛塔 | – | 双SSPA |
y Di.SSPA,巴里大学土壤、植物和食品科学系。 |
对每个种群 20 个基因型的叶子材料进行取样并储存在 -80°C 下直至使用。对于富含多糖的物种,如 A.cepa, 去除多糖的第一步对于获得优质 DNA 至关重要,因此按照以下所述在 STE 缓冲液(0.25 M 蔗糖、0.03 M Tris、0.05 M EDTA)中进行初始洗涤 [52]。 CTAB法提取总DNA [53] 最后用 Nano Drop 2000 紫外可见分光光度计 (ThermoScientific, Waltham, MA, USA) 和 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检查质量和浓度。
SSR分析
开发的 16 个 EST-SSR 引物组合 [54] 之前在遗传多样性研究中进行了测试 [43] 和 [44] 和21个基因组SSR [45-一] 进行筛选以评估其适用性(补充表 S4)。使用经济荧光标记方法进行基因分型,其中将 M13 尾添加到每个正向 SSR 引物中 [56]。 PCR 混合物在 20 gL 反应体系中制备,其中包含:50 ng 总 DNA、0.2 mM dNTP 混合物、1X PCR 反应缓冲液、0.8 U DreamTaq DNA 聚合酶(Thermo Scientific,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)、0.16 gM 反向引物、0.032 gM 延伸有 M13 序列的正向引物 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3') 和 0.08 gM 标记有 FAM 或 NED 荧光染料的通用 M13 引物(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。 PCR 反应在 SimpliAmp(Applied Biosystems,CA,USA)热循环仪中进行,大多数引物对的条件如下:94°C 5 分钟,40°C 94 秒 30 个循环,58°C 45 秒和 72°C 45 秒,最终伸长率在 72°C 5 分钟。对于 ACM446 和 ACM449,应用降落 PCR,在 60 °C 至 55 °C 的温度下退火 10 个循环,在 30 °C 下进行 55 个循环,然后在 5 °C 下最终延伸 72 分钟。将 PCR 产物装入 96 孔板中,并与 14 gL Hi-Di 甲酰胺(Life Technologies,卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国)和 0.5 gL GeneScan 500 ROX Size Standard(Life Technologies,卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国)混合。通过 ABI PRISM 3100 Avant 遗传分析仪(Life Technologies,卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国)毛细管测序机解析扩增子,其中等位基因被评分为共显性,并使用 GeneMapper 软件版本 3.7 进行分配。
软件 GenAlEx 6.5 [57] 和鹿3.0.7 [58] 用于估计等位基因数量 (Na)、有效等位基因数量 (Ne)、观测杂合度 (Ho)、预期杂合度 (He)、多态信息内容 (PIC)、香农信息指数 (I) 和固定指数 (Fis) )对于每个 SSR 位点。
遗传多样性评估
GenAlEx 6.5 评估了洋葱群体之间和内部遗传变异的分层划分 [57] 通过分子方差分析 (AMOVA) 和 999 bootstrapping 来检验显着性。此外,使用 GenAlEx 6.5 软件通过计算所有 SSR 位点上 Ho、He 和 Fis 的平均值来估计每个群体内的多样性。
通过 STRUCTURE v.2.3.4 软件中实现的基于贝叶斯模型的聚类算法推断群体结构 [59]。该数据集使用多个假设集群 (K) 运行,范围从 1 到 10,为每个 K 值设置 100,000 次独立运行。为了验证结果的一致性,每次运行均在混合模型和群体间独立等位基因频率下进行了 100,000 次初始老化期和 XNUMX 次马尔可夫链蒙特卡罗 (MCMC) 迭代。最可能的 K 值是通过 AK 方法确定的,描述为 [60],在基于网络的程序 STRUCTURE HARVESTER 中 [61]。当个体群体的隶属系数(q值)高于0.7时,该个体群体被分配到特定的簇,否则被认为是混合血统。
进行主坐标分析,以便可视化 Nei 遗传距离矩阵揭示的种质之间的遗传关系模式(补充表 S5)。基于等位基因频率,在 POPTREEW 软件中实施未加权配对算术平均法 (UPGMA) 聚类分析,构建遗传距离树状图 [62]。应用 Bootstrapping 来评估分层聚类的置信度,设置数据集的 100 次重采样。最后,MEGA X 软件 [63] 被用作树绘图软件。
补充材料: 以下内容可在线获取 http://www.mdpi.com/2223-7747/9/2/260/s1. 表 S1:ARO、MCO 和 TRO 灯泡的形态特征。表 S2:计算 ARO 地方品种和 TRO 和 MCO 地方品种的杂合性和固定指数。表 S3:Fpt 参数的成对值。表 S4:研究中使用的 SSR 列表。表 S5。 Nei 遗传距离的成对群体矩阵。图 S1:K 值随 Evanno Delta K 变化的折线图。
作者贡献: CL和LR构思了研究并设计了实验; CL和PI进行分子标记分析; ARM 和 VZ 进行了现场试验; RM、SP、GR、CL参与数据分析; RM 和 CL 撰写了手稿。所有作者均已阅读并同意稿件的出版版本。
资金: 这项工作由阿普利亚地区项目“阿普利亚蔬菜物种生物多样性”——Programma di Sviluppo Rurale per la Puglia 2014-2020 资助。米苏拉10—索托米苏拉10.2;授予 CUP H92C15000270002,意大利。
致谢: 感谢“Azienda Agricola Iannone Anna”和“Associazione produttori della vera cipolla rossa di Acquaviva”提供了实验中使用的植物材料。
利益冲突: 作者宣称没有利益冲突。
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